Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам список литераруты

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов. Минимальная подавляющая концентрация. Чувствительные (susceptible) и резистентные (resistant) микроорганизмы.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ярославская государственная медицинская академия

Выполнила: студентка 3 курса 11 группы

Преподаватель: Серёжина В.В.

1. Диско-диффузные методы

2. Методы разведения

3. Интерпретация результатов определения чувствительности

4. Чувствительные микроорганизмы (susceptible)

5. Резистентные микроорганизмы (resistant)

6. Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)

Список использованной литературы

1. Диско-диффузные методы

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам:

· с использованием дисков с антибиотиками

· с помощью Е-тестов

· разведение в жидкой питательной среде (бульоне)

· разведение в агаре

1)При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35 о -37 о С в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах (рис. 1).

Рисунок 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

2. Методы разведения

Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение ночи при температуре 35 о -37 о С проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 3).

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) — наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий

Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

3. Интерпретация результатов определения чувствительности

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).

Рисунок 4. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.

Пограничные концентрации не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться, в зависимости от изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты и микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США (National Committee for Clinical Laboratory Standards — NCCLS). В настоящее время стандарты NCCLS признаны в мире и используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях. чувствительность бактерия антибиотик диффузионный

Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ:  В лактамные антибиотики список

4. Чувствительные микроорганизмы (susceptible)

Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.

При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).

5. Резистентные микроорганизмы (resistant)

К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.

6. Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)

Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.

С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.

Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) — это наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного периода времени

Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.

В заключение хотелось бы отметить, что на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.

Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий

Источник: http://revolution.allbest.ru/medicine/00832251_0.html

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРОБОВ К АНТИБИОТИКАМ

Многие бактерии и грибки продуцируют вещества — антибиотики, угнетаю­щие жизнедеятельность микробов других видов, в том числе патогенных. Анти­биотики известны против всех возбудителей бактериальных инфекций. Каждый антибиотик имеет свой антимикробный спектр действия. Но чувствительность бактерий к антибиотику может снизиться или даже исчезнуть за счет появления резистентных вариантов у данного вида микробов. Поэтому при возникновении бактериальной инфекции необходимо определить степень чувствительности ее возбудителя к антибиотикам с тем, чтобы подобрать из них наиболее эффек­тивный для целее и лечения и профилактики данной инфекции. Активность анти­биотика измеряется в единицах действия (ЕД).

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам чаще при­меняют метод диффузии в агар с использованием дисков, содержащих антибио­тики, и метод серийных разведений в жидкой и плотной питательной среде.

Метод диффузии в агар с применением дисков. Он прост в выполнении и позволяет быстро получить результат, что весьма важно для срочного проведе­ния противоэпизоотических мероприятий.

Пробу ставят в чашках с 2%-ным МПА или агаром Хоттингера, содержащим 120-140 мг% аминного азота, или на специальных плотных средах с оп­тимальным для каждого микроба рН. Среду наливают в чашки по 20 мл следя чтобы слой агара был равномерным и толщиной не менее 4-5 мм. После застывания агара на дно чашек наносят 4-5 точек на равном удалении друг от дру­га, в 2,5 см от центра и в 2 см от края чашки.

Смыв с каждой испытуемой агаровой культуры доводят до концентрации 10-20 единиц мутности по оптическому стандарту. 1 мл, взвеси вносят в отдель­ную чашку и покачиванием распределяют по всей поверхности агара остаток отсасывают пипеткой. Чашки с посевами подсушивают при 37 0 С в течение 20­-25 мин.

С помощью пинцета диски с одним антибиотиком раскладывают по чашкам в намеченные точки и слегка прижимают их к среде. Перед раскладыванием дис­ков с каждым другим антибиотиком конец пинцета протирают спиртом и флам­бируют. Посевы с дисками выдерживают 3 ч при, комнатной температуре. За это время диффузия антибиотиков в агар в основном заканчивается. Наиболь­шие концентрации антибиотиков будут под дисками, а по мере удаления от дисков они уменьшаются. Затем чашки ставят вверх дном в термостат при 37 0 С на 16-18 ч.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ:  Антибиотики для жкт список

Учет результатов. В зависимости от чувствительности микроба вокруг диска образуется большая или меньшая зона задержки роста на фоне сплошного газона культуры. С помощью металлической линейки или полоски миллиметро­вой бумаги измеряют по дну чашки диаметры зон задержки роста, включая размер дисков. Если зона больше 25 мм, микроб высокочувствителен к данно­му антибиотику; при размере зоны 15-25 мм микроб чувствителен; если диа­метр зоны 11-14 мм, микроб малочувствителен, а при меньшем размере зоны илн полном отсутствие задержки роста микроб устойчив к антибиотику. Рост от дельных колоний испытуемого микроба в пределах зоны свидетельствует о наличии в культуре устойчивых к антибиотику особей.

Стандартные бумажные диски имеют диаметр 5 мм и пропитаны антибио­тиками в такой концентрации, которая подавляет рост чувствительных микробов в зоне диаметром 28-32 мм. Хранят диски в плотно закрытых склянках или флаконах в сухом месте при комнатной температуре.

Пригодность новых партий питательных сред и дисков с антибиотиками к постановке пробы проверяют с соответствующими для каждого антибиотика тест микробами.

Необходимо употреблять питательные среды с одинаковым содержанием агар-агара, аминоазота и рН, пользоваться чашками с ровным дном и одина­ковой толщиной агара. При нарушении этих условий диаметр зоны может из­мениться на 6-10 мм. Не следует брать в опыт микробы, дающие скудный или наоборот, обильный и ползучий рост. Срок между посевом культур и наложением дисков не должен превышать 30 мин.

При выявлении устойчивых к антибиотикам культур микробов проводят кон­трольные исследования методом серийных разведений в соответствии с методи­ческими указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбуди­телей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных.

Источник: http://studopedia.ru/10_2844_opredelenie-chuvstvitelnosti-mikrobov-k-antibiotikam.html

АНТИБИОТИКИ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ

Цель занятия. Ознакомить студентов с методами определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Оборудование и материалы. Стерильные чашки Петри с МПА, пробирки с чистой культурой стафилококка и кишечной палоч­ки, стерильные градуированные «концевые» пипетки на 2 мл, ре­зиновые груши, набор стандартных дисков с разными антибио­тиками, стерильные пинцеты, линейки.

Антибиотики. Эти вещества, образуемые бактериями, грибами, растениями, животными тканями, способны убивать микроорга­низмы или подавлять их рост. Абсолютное большинство извест­ных антибиотиков получают из актиномицетов. Бактерии синте­зируют такие антибиотики, как полимиксины, грамицидины, бацитрацин, гризин. Из грибов выделены пенициллины, цефалоспорины, фумагиллин, гризеофульвин, из животных тка­ней — эритрин, экмолин, из высших растений — аллицин и др. Часть антибиотиков получают химическим синтезом (левомицетин), а большинство — биосинтезом. Активность препаратов оп­ределяют бактериологическими или физико-химическими мето­дами. Биологическую активность антибиотиков выражают в ус­ловных единицах действия — ЕД. За 1 ЕД принимают специфи­ческую активность, содержащуюся в 1 мкг чистого препарата, но для бензил пенициллина 1 ЕД равна 0,5988 мкг химически чистой натриевой соли препарата. Активность товарных антибиотиков чаще всего выражают в мкг активного вещества, содержащегося в 1 мг препарата.

Успех лечения инфекционных заболеваний человека и живот­ных зависит от выбора эффективного лекарственного средства с учетом чувствительности к нему возбудителя болезни. Материал для лабораторного исследования следует брать до лечения антимикробными препаратами. Чувствительность микроорганизма к антибиотикам определяют с чистой культурой возбудителя.

Методы определения чувствительности микроорганизмов к анти­биотикам. К ним относят метод диффузии в агар, метод серий­ных разведений (на жидкой и плотной питательных средах) и ускоренные методы.

Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков). Это наибо­лее простой в исполнении метод. В качестве питательной среды применяют МПА, агар на переваре Хоттингера с содержанием 120. 140мг% аминного азота (рН 7,2. 7,4) или агар фирмы «Дифко». Диски с антибиотиками (диаметр 5. 6 мм) готовят из специальных сортов фильтровальной бумаги. Каждый диск со­держит определенное количество антибиотика, которое указано на этикетке флакона. Во флакон насыпают силикагель, который впитывает влагу и служит индикатором: при переувлажнении ме­няет окраску с синей на розовую. При изменении окраски силикагеля во флаконе диски для использования непригодны. Флако­ны с дисками хранят при температуре 4. 20 "С.

Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри по 20 мл (толщина слоя 4. 5 мм). Перед посевом чашки со сре­дой досушивают в термостате. Для посева используют суточную бульонную культуру или смывы суточной агаровой культуры. 1 мл микробной суспензии в физиологическом растворе (кон­центрация клеток 10 9 /мл) наносят на агар и покачиванием чаш­ки распределяют по поверхности питательной среды. Избыток жидкости удаляют стерильной пастеровской пипеткой. Засеян­ные чашки Петри подсушивают при комнатной температуре 30. 40 мин, а затем на поверхность среды стерильным пинцетом накладывают, плотно прижимая, диски с разными антибиоти­ками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашки. Чашки с дисками выдерживают в термостате при 37 °С 18 ч в положении вверх дном.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ:  Антибиотики в гинекологии список

Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий, формируя таким образом вокруг диска зону отсутствия роста (рис. 49). Ближе к диску концентрация ан­тибиотика в агаре выше, по мере удаления от диска концентра­ция снижается. Следовательно, чем больше диаметр зоны задер­жки роста вокруг антибиотика, тем более чувствительна к нему исследуемая культура.

Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста микроорганизмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точ­ностью до 1 мм. Отсутствие зоны задержки роста микроорганиз­мов вокруг диска указывает на устойчивость исследуемой культу­ры к данному антибиотику. При зоне задержки роста до 14 мм говорят о малой чувствительности к антибиотику, от 15 до 25 мм — о достаточной чувствительности, свыше 25 мм — о высо­кой чувствительности.

а — к пенициллину; б— к стрептомицину; в — к неомицину; /—зона задер­жки роста (стерильная зона); 2 — сплошной рост бактерий на поверхности питательной среды; 3 — бумажный диск с антибиотиком

Чтобы получить более точные результаты исследования, необхо­димо соблюдать стандартные условия при постановке опыта. Для проверки точности и стандартности определения чувствительности к антибиотикам Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) реко­мендует контролировать диски на эталонных штаммах микроорга­низмов, которыми служат три культуры из Американской коллекции типовых культур или из Национальной коллекции типовых культур в Англии: S. aureus (АТСС 25923, №СТС 6571), E. coli (АТСС 25922, № СТС 10418), P. aeruginosa (АТСС 27853, № СТС 10662).

Метод серийных разведений. Для проведения опыта готовят ос­новные растворы антибиотиков, используя стандарты антибио­тиков. На этикетке ампулы со стандартом указана концентрация антибиотика в ЕД/мл или мкг/мл. Навески бензил пенициллина калиевой или натриевой соли, ампициллина тригидрата, оксациллина натриевой соли, цефалотина, цефалексина растворяют в 1/15M фосфатном буфере. Основные растворы тетрациклиновых антибиотиков готовят на 0,01 н. растворе соляной кислоты. Для приготовления основных растворов нео-, моно-, канамицина ис­пользуют дистиллированную воду. Концентрация основных ра­створов антибиотиков 1000 мкг/мл.

Метод серийных разведений на жидкой питательной среде: при определении чувствительности к антибиотикам для основной массы микроорганизмов использу­ют МПБ или бульон на переваре Хоттингера, для стрептококков в среду добавляют 1 % глюкозы, для патогенных грибов исполь­зуют среду Сабуро.

Агаровые или бульонные культуры микроорганизмов предва­рительно разводят физиологическим раствором до концентрации клеток 5 • 10 6 /мл.

Схема опыта приведена в таблице 2.

Учет результатов: наименьшее количество антибиотика, даю­щее визуально полную задержку роста (бульон прозрачный), со­ответствует минимальной подавляющей концентрации препара­та (МПК). Минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) определяют высевом на плотные питательные среды из последних прозрачных пробирок, которые предварительно встряхивают. Наименьшее количество антибиотика в пробирке, содержимое которой после инкубирования в течение 24. 72 ч не дало роста бактерий при высеве на питательную среду, принима­ют за МБцК.

Метод серийных разведений на плотной питательной среде: для определения чувствительности к антибиотикам большинства микроорганизмов используют МПА или агар на переваре Хоттингера с содержанием аминного азота 120. 140мг/мл, рН 7,2. 7,4. Приготовленный основной ра­створ антибиотиков разводят в плотной питательной среде. Для этого к расплавленному и охлажденному до 55 ºС агару, разлито­му в широкие пробирки по 18 мл, добавляют по 2 мл соответству­ющего разведения определенного антибиотика, тщательно пере­мешивают и переливают в стерильную чашку Петри. После зас­тывания агара чашки Петри подсушивают в течение 1 ч. Конт­рольные чашки Петри с агаром не содержат антибиотика. Все чашки Петри делят на сектора, каждый из которых засевают ис­следуемой культурой. Посев делают бактериологической петлей из микробной суспензии с концентрацией клеток 10 6 . 10 7 /мл. Чашки помещают в термостат при 37 ºС на 20. 24 ч.

Наименьшую концентрацию антибиотика, при которой на­блюдают полную задержку роста бактерий на агаре или рост еди­ничных колоний, принимают за МПК препарата. В том случае, когда рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме конт­рольной, считают, что исследуемые концентрации антибиотиков превышают МПК препарата. Если на всех чашках отмечают рост культуры, это значит, что микроорганизм устойчив ко всем кон­центрациям антибиотика.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Определить чувствительность культуры стафилококка к анти­биотикам методом бумажных дисков.

1.Что такое антибиотики?

2.Как используют антибиотики в ветеринарии?

3.Какими методами определяют чувствительность микроорганизмов к анти­биотикам?

4.Что принимают за минимальную подавляющую концентрацию антибиотика?

Источник: http://megaobuchalka.ru/7/34513.html

Ссылка на основную публикацию